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溶氧對重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的影響
  • 發(fā)布日期：2009-09-14      瀏覽次數(shù)：4359

      • 腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine,SAMe）是甲硫氨酸的活性形式,1951年為Cantoni所發(fā)現(xiàn),在生物體內(nèi)
      由甲硫氨酸和ATP經(jīng)SAMe合成酶合成。SAMe是一種重要的生理活性物質(zhì),參與了生物體內(nèi)40多種生化反應(yīng),
      SAMe代謝異常將會導(dǎo)致肝臟疾病和各種精神混亂。正是于SAMe如此復(fù)雜地涉及到重要的生化反應(yīng),因此表現(xiàn)
      出廣泛治療作用,對關(guān)節(jié)炎、抑郁癥和肝臟功能紊亂等均有較好地治療作用,而且還是預(yù)防癌癥、心血管疾病和抗衰老的保健藥物[1]。正是由于腺苷蛋氨酸廣泛的藥用價值,引起了國內(nèi)外眾多研究者的興趣。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來發(fā)展起來的一種的真核表達(dá)系統(tǒng),由于其具有強(qiáng)烈的好氧生長偏愛性[2],因此在對重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)腺苷蛋氨酸的研究中,本文重點研究了發(fā)酵液中溶解氧濃度對重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的影響。
      1　材料與方法
      1·1材料
      1·1·1菌株:重組畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌,由本公司保存。
      1·1·2培養(yǎng)基:YPD培養(yǎng)基[3]。
      1·2方法
      1·2·1測定方法:HPLC法測定發(fā)酵液中SAMe的含量[3];用溶氧電極（梅特勒-托利多儀器有限公司）測定發(fā)酵液中溶氧濃度。
      1·2·2培養(yǎng)方法[3]:將保藏菌種接種到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基上,劃線培養(yǎng),置30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。挑選生長良好的單菌落接種到Y(jié)PD種子培養(yǎng)基中,在30℃,300rpm搖床中培養(yǎng)16~24h后,按照1%的接種量接入裝有10L培養(yǎng)基（10g·L-1酵母膏,10g·L-1蛋白棟,0·05M磷酸鉀緩沖液,13·4 g·L-1含有硫氨酸的酵母基本氮源,4×10-4g·L-1生物素,2 g·L-1甘油,20 g·L-1甲醇,7·5 g·L-1L-甲硫氨酸）的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵,控制pH值5·0。發(fā)酵約20h,待甘油耗盡后,繼續(xù)流加甘油培養(yǎng)基（50%,含L-甲硫氨酸10 g·L-1）約10h,當(dāng)菌濕重達(dá)到200 g·L-1后,開始流加甲醇,誘導(dǎo)表達(dá)腺苷蛋氨酸。
      1·2·3發(fā)酵液中溶氧控制方法:通過控制發(fā)酵過程中的通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、罐壓和輔助通入純氧等方法來控制發(fā)酵液中的溶解氧濃度。當(dāng)發(fā)酵液中溶氧值低于目標(biāo)值時,首先提高通氣量來改善發(fā)酵液中的溶氧情況;當(dāng)采用提高通氣量不能有效改善發(fā)酵液中溶氧情況時,可適當(dāng)提高攪拌轉(zhuǎn)速來控制;同理,依次采取提高罐壓和輔助通入純氧來控制發(fā)酵液中的溶氧濃度。
      2　結(jié)果與討論
      為了考察發(fā)酵液中不同溶氧濃度對重組畢赤酵母表達(dá)腺苷蛋氨酸的影響,我們設(shè)計了3組試驗,*組試驗,在整
      個發(fā)酵過程中不控制發(fā)酵液中的溶氧;第二組試驗,控制發(fā)酵過程中的溶氧在30%左右;第三組,控制發(fā)酵過程中的溶氧在50%左右。試驗結(jié)果見表1。

       

      　　在重組畢赤酵母高密度發(fā)酵過程中,為了獲得高生物量和高濃度表達(dá)產(chǎn)物,通常投入幾倍于生物量的基質(zhì)以滿足菌體迅速生長繁殖及大量表達(dá)基因產(chǎn)物的需要。由于發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)極為豐富,使得重組畢赤酵母菌株在接種并度生長延遲期,進(jìn)入對數(shù)生長期后,菌株生長極為迅速,進(jìn)而需要消耗大量的氧氣。因此,發(fā)酵液中的溶氧值迅速降低,當(dāng)不采取任何措施改善溶氧條件時,發(fā)酵液中的溶氧濃度迅速降低到0,并一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束。由于氧供給的嚴(yán)重不足,使得細(xì)胞的生長收到了限制,盡管溶氧低時生成的細(xì)胞膜中不飽和脂肪的含量高,流動性大,易于吸收甲硫氨酸,但是由于細(xì)胞的生長受到限制,不能大量供給ATP,因此zui終影響了產(chǎn)物的高濃度表達(dá),使得zui終SAMe的產(chǎn)量很低,僅僅0·5 g·L-1;此時氧供給便成了細(xì)胞生長和產(chǎn)物表達(dá)的限制因素。
      當(dāng)溶氧控制在30%左右時,細(xì)胞生長迅速,并且甘油得到充分氧化,產(chǎn)生了大量的ATP,在腺苷蛋氨酸合成酶的作
      用下,胞內(nèi)大量的ATP和甲硫氨酸合成了腺苷蛋氨酸,從而獲得了腺苷蛋氨酸的高濃度表達(dá),zui終發(fā)酵結(jié)束時SAMe產(chǎn)量達(dá)到了2·3 g·L-1。但是,當(dāng)控制發(fā)酵液中溶氧濃度在50%左右時,由于發(fā)酵液中溶氧濃度過高,使得甲硫氨酸的氧化嚴(yán)重,不僅zui終SAMe產(chǎn)量降低了,并且甲硫氨酸的轉(zhuǎn)化率也大大降低。并且在控制較高溶氧時,不僅要提高通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速,并且還要通入純氧。使得生產(chǎn)成本大為增加,但是zui終SAMe的產(chǎn)量卻有所降低,因此當(dāng)控制發(fā)酵過程中的溶氧過高時,對重組畢赤酵母表達(dá)腺苷蛋氨酸來說也是不利的。
      3　結(jié)論
      畢赤酵母（Pichia pastoris）系統(tǒng)是近年來發(fā)展很快的一個真核表達(dá)系統(tǒng)。利用畢赤酵母系統(tǒng)的zui大優(yōu)點是便于進(jìn)
      行高密度培養(yǎng)和放大規(guī)模培養(yǎng),而且表達(dá)量高,產(chǎn)品易于純化。在高密度發(fā)酵體系中,pH和溫度的控制相對容易,而o的傳遞供給是一個關(guān)鍵因素,如何針對不同的產(chǎn)品將發(fā)酵液中的溶氧濃度控制在一個較為合理的水平往往是高密度發(fā)酵工藝研究的一個重點。
      本文通過研究發(fā)現(xiàn),對于重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸過程,控制整個發(fā)酵過程中的溶氧濃度在30%
      左右對于SAMe的生產(chǎn)是比較有利的。